基因毒性雜質(zhì)（或遺傳毒性雜質(zhì)）是指化合物本身能夠直接或間接損傷細(xì)胞 DNA，產(chǎn)生 基因突變或體內(nèi)誘變，具有致癌可能或者傾向的一類物質(zhì)。近年來，已經(jīng)上市的藥品中由于存在痕量的基因毒性雜質(zhì)而引發(fā)大規(guī)模醫(yī)療事故，繼而藥品被召回的事件時(shí)有發(fā)生。FDA、 EMA、ICH 先后發(fā)布了對(duì)基因毒性雜質(zhì)的指導(dǎo)原則，推薦使用毒理學(xué)關(guān)注閾值 TTC（1.5 μg/day）作為基因毒性雜質(zhì)的可接受限度。我國 2020 版《中國藥典》新增了《遺傳毒性雜質(zhì)控制指導(dǎo)原則》，藥企在研發(fā)過程中越來越關(guān)注基因毒性雜質(zhì)的控制和檢測。

    磺酸酯類化合物作為一類典型的基因毒性雜質(zhì)，可以直接或代謝活化后間接地烷基化 DNA。現(xiàn)有的磺酸酯類化合物氣相和氣質(zhì)檢測方法通常需要進(jìn)行衍生，操作繁瑣。運(yùn)用 GC進(jìn)行檢測，方法定性能力差且靈敏度低，GC-MS 方法雖然可以提高檢測靈敏度，但對(duì)于一些基質(zhì)復(fù)雜的藥物抗干擾能力較差。相較之下，GC-MS/MS 方法具有較高的抗干擾能力且檢測靈敏度高。

    本文針對(duì)三種對(duì)甲苯磺酸酯基因毒性雜質(zhì)，基于自主研制的 GC-MS/MS 平臺(tái)建立了三種對(duì)甲苯磺酸酯的快速且高靈敏度的檢測方法。

實(shí)驗(yàn)部分

標(biāo)準(zhǔn)品、試劑和設(shè)備

    標(biāo)準(zhǔn)品：對(duì)甲苯磺酸甲酯、對(duì)甲苯磺酸乙酯、對(duì)甲苯磺酸異丙酯均購自 Stanford Analytical Chemicals，于 4℃冰箱保存。

    試劑：丙酮和乙酸乙酯均為色譜級(jí)。

    儀器：GC2000 氣相色譜、EXPEC 5231 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀。

測試方法

三種對(duì)甲苯磺酸酯監(jiān)測離子對(duì)、駐留時(shí)間等參數(shù)見下圖 1。

圖 1 三種對(duì)甲苯磺酸酯監(jiān)測離子對(duì)等質(zhì)譜參數(shù)

樣品前處理

（1） 水溶性藥品

    準(zhǔn)確稱取 0.1 g 藥品粉末，加入 2 mL 水，振搖均勻，超聲 10 min，再加入 2 mL 乙酸乙酯，振搖混勻后充分超聲提取，取上層有機(jī)相經(jīng)無水硫酸鈉除水后，過濾膜，上機(jī)測試。

（2） 脂溶性藥品

    準(zhǔn)確稱取 0.1 g 藥品粉末，加入 2 mL 乙酸乙酯，振搖均勻，超聲 10 min，過濾膜，上機(jī)測試。

線性和檢出限

配制系列梯度對(duì)甲苯磺酸酯類化合物的混合標(biāo)樣溶液(5.0 μg/L、10.0 μg/L、20.0 μg/L、50.0 μg/L、100.0 μg/L、200.0 μg/L)，以各目標(biāo)物的定量離子色譜峰面積為縱坐標(biāo)，目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度(μg/L)為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合后的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖 2 所示，在對(duì)應(yīng)的線性范圍內(nèi)，3 種對(duì)甲苯磺酸酯類化合物的線性系數(shù) r 均在 0.995 以上，線性良好。以 5 μg/L 標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，按照 S/N=10 和 S/N=3 計(jì)算定量限和檢出限，檢出限為 0.4~0.8 μg/L，定量限為1.3~2.7 μg/L，具體結(jié)果見表 1。對(duì)甲苯磺酸酯類化合物總離子流圖如圖 3 所示。

圖 2 對(duì)甲苯磺酸酯類化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖 3 20.0 μg/L 對(duì)甲苯磺酸酯類化合物總離子流圖

表 1 對(duì)甲苯磺酸酯各組分信噪比（5 μg/L 濃度水平下）以及檢出限和定量限

重復(fù)性

    選取 20 μg/L 的對(duì)甲苯磺酸酯類化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)進(jìn)樣 6 次，考察保留時(shí)間、峰面積的重復(fù)性，其結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差如下圖所示。各組分保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 RSD 均小于等于 0.05%，峰面積的 RSD 均小于 5%。

加標(biāo)回收率

    對(duì)空白藥品進(jìn)行加標(biāo)回收率測試，加標(biāo)濃度為 1 μg/g，連續(xù)進(jìn)樣三針，各目標(biāo)化合物計(jì)算濃度（單位為μg/L）與回收率結(jié)果，3 種對(duì)甲苯磺酸酯平均回收率在 80%~110%之間。

樣品測試

    按照 2.3 中樣品前處理方法處理實(shí)際藥品，實(shí)際藥品中三種對(duì)甲苯磺酸酯均未檢出，色譜圖見圖 4。

圖 3 實(shí)際藥品色譜圖

結(jié)論

    本文建立了一種使用譜育科技三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀 EXPEC 5231 測定藥品中 3 種對(duì)甲苯磺酸酯類化合物的分析方法。本文考察了該方法的線性、精密度、靈敏度和準(zhǔn)確度等，結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，相關(guān)系數(shù)大于 0.995，方法精密度低于 10%，檢出限低于 1 μg/L，定量限低于 3 μg/L，回收率在 80%~110%之間。因此，本方法可以對(duì)藥品中 3 種對(duì)甲苯磺酸酯類化合物進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、靈敏的定量分析。

設(shè)備與耗材方案

一、EXPEC 5231 系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)配置詳情