基因毒性雜質(zhì)（或遺傳毒性雜質(zhì)）是指化合物本身能夠直接或間接損傷細胞 DNA，產(chǎn)生 基因突變或體內(nèi)誘變，具有致癌可能或者傾向的一類物質(zhì)。近年來，已經(jīng)上市的藥品中由于存在痕量的基因毒性雜質(zhì)而引發(fā)大規(guī)模醫(yī)療事故，繼而藥品被召回的事件時有發(fā)生。FDA、 EMA、ICH 先后發(fā)布了對基因毒性雜質(zhì)的指導原則，推薦使用毒理學關注閾值 TTC（1.5 μg/day）作為基因毒性雜質(zhì)的可接受限度。我國 2020 版《中國藥典》新增了《遺傳毒性雜質(zhì)控制指導原則》，藥企在研發(fā)過程中越來越關注基因毒性雜質(zhì)的控制和檢測。

    亞硝胺類化合物作為一類典型的基因毒性雜質(zhì)，具有強致癌性。亞硝胺類化合物由前體物質(zhì)硝酸鹽、亞硝酸鹽和胺類化合物通過化學或生物學途徑合成。這類化合物廣泛存在于環(huán)境、飲用水和食品中。自纈沙坦事件發(fā)生后，亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)在全球受到廣泛關注。本文針對 12 種亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)，基于自主研制的 GC-MS/MS 平臺建立了 12 種亞硝胺的快速且高靈敏度的檢測方法。

實驗部分

標準品、試劑和設備

    標準品：12 種亞硝胺類化合物混合標準溶液購自阿爾塔科技有限公司，于-20℃冰箱保存。試劑：甲醇和乙酸乙酯均為色譜級。

    儀器：GC2000 氣相色譜、EXPEC 5231 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀。

測試方法

樣品前處理

    準確稱取 0.02 g 藥品粉末置于 15 mL 離心管中，加入 2 mL 甲醇/乙酸乙酯（1:1，v/v），振搖均勻，超聲萃取 10 min，離心 5 min，過濾膜，上機測試。

線性和檢出限

    配制系列梯度的 12 種亞硝胺混合標樣溶液（1.0 μg/L、2.0 μg/L、5.0 μg/L、10.0 μg/L、20.0 μg/L、50.0 μg/L、100.0 μg/L、200.0 μg/L、500.0 μg/L），以各目標物的定量離子色譜峰面積為縱坐標，目標物標準溶液的質(zhì)量濃度（μg/L）為橫坐標，建立標準曲線。N-亞硝基吡咯烷（NPYR）和 N-亞硝基二丙胺（NDPA）的線性濃度范圍為 5.0~500.0 μg/L，其他 10 種亞硝胺的線性濃度范圍為1.0~500.0 μg/L。在對應的線性范圍內(nèi)，12 種亞硝胺的線性系數(shù) r 均在 0.997 以上，線性良好。以 5 μg/L 標準溶液進樣，分別按照S/N=10 和 S/N=3 計算定量限和檢出限，檢出限為 0.1~0.7 μg/L，定量限為 0.2~2.4 μg/L，具體結果見表 1。12 種亞硝胺類化合物疊加色譜圖如圖1 所示。

圖 1 5.0 μg/L 濃度水平下 12 種亞硝胺疊加色譜圖

表 1 亞硝胺各組分信噪比（5.0 μg/L 濃度水平下）以及檢出限和定量限

重復性

    選取 10 μg/L 和 50 μg/L 的亞硝胺混合標準溶液，連續(xù)進樣 6 次，考察保留時間、峰面積的重復性。10 μg/L 的亞硝胺混合標準溶液各組分保留時間的 RSD 均小于等于 0.19%，峰面積的 RSD 均小于 5%。50 μg/L 的亞硝胺混合標準溶液各組分保留時間的 RSD 均小于等于 0.14%，峰面積的 RSD

均小于 5%。

加標回收率

    對空白藥品進行加標回收率測試，加標濃度為 5 mg/kg，連續(xù)進樣三針，各目標化合物計算濃度（單位為μg/L）與回收率結果如下所示，12 種亞硝胺平均回收率在 75%~110%之間。

樣品測試

    按照 2.3 中樣品前處理方法處理成品藥鹽酸雷尼替丁膠囊，其中 N-亞硝基二甲基胺

（NDMA）受基質(zhì)干擾嚴重，其他亞硝胺均未檢出，實際藥品總離子流圖見圖 4。

圖 2 實際藥品總離子流圖

結論

    本文建立了一種使用譜育科技三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀EXPEC 5231 測定藥品中 12 種亞硝胺的分析方法。本文考察了該方法的線性、精密度、靈敏度和準確度等，結果顯示標準曲線線性良好，相關系數(shù)大于 0.997，方法精密度低于 5%，檢出限低于 1 μg/L，定量限低于 3 μg/L，回收率在 75%~110%之間。3 ppb 的 LOQ 對應藥物或藥品 1%溶液中 0.3 ppm 的定量限，這個值滿足最大劑量為 5000 mg（或更低）的藥物產(chǎn)品所要求的的靈敏度水平，適用于大部分市售藥物。因此，本方法可以對藥品中 12 種亞硝胺進行快速、準確、靈敏的定量分析。

設備與耗材方案

一、EXPEC 5231 系統(tǒng)標準配置詳情